
<html>

<body>

<x-sigsep><p></x-sigsep>

Hola a todos:<br><br>

Viernes 22/09, 10:00, Aula Busch, 1er. piso, Conferencia dentro del

Seminario de Fotoquimica del DQIAyQF.<br><br>

<font face="Arial, Helvetica">Los esperamos,<br>

Enrique San Roman<br><br>

<br>

</font><div align="center"><font face="Arial, Helvetica" size=4><b>Quantitative

FCS and FRET: Determination of the Confocal Volume and Improving the

Accuracy of Single Molecule nm-Distance Measurements<br><br>

</b></font>Steffen Ruettinger*<br><br>

</div>

<font face="Arial, Helvetica">Quantitative distance measurements are

difficult to obtain in spite of the strong distance<br>

dependency of the energy transfer efficiency. One problem for the

interpretation of the<br>

FRET efficiency is the so-called zero efficiency peak caused by FRET

pairs with missing<br>

or non-fluorescent acceptors. Other problems occurring are direct

excitation of the acceptor,<br>

spectral crosstalk and the determination of the quantum efficiency of the

dyes as<br>

well as the detector sensitivity.<br>

Our approach to overcome these limitations is based on the pulsed

interleaved excitation<br>

(PIE) of both, the acceptor and the donor molecule. PIE is used to excite

the acceptor dye<br>

independently of the FRET process and to prove its existence via

fluorescence. This<br>

technique allows to differentiate a FRET molecule, even with a very low

FRET efficiency,<br>

from a molecule with an absent or non fluorescing acceptor. Crosstalk,

direct acceptor<br>

excitation and molecular brightness of acceptor and donor molecules are

determined by<br>

analyzing the data with Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). FRET

efficiencies<br>

of the same data set are also determined by analyzing the lifetimes of

the donor fluorophores.<br>

The advantages of the PIE-FRET approach are demonstrated on a

polyproline<br>

assay labeled with Alexa-555 and Alexa-647 as donor and acceptor,

respectively.<br>

Although FCS in principle has the potential to measure absolute

concentrations and diffusion<br>

coefficients, quantitative results are not easy to obtain due to

difficulties in the determination<br>

of the exact size and shape of the confocal volume. This restricted FCS

to<br>

relative measurements mainly. The determination of the confocal volume in

situ is difficult,<br>

because it is sensitive to optical alignment and aberrations, optical

saturation and variations<br>

of the index of refraction as observed in biological specimen.<br>

In the second part of the contribution, we compare different techniques

to characterize<br>

the confocal volume and to obtain the confocal parameters by FCS-curve

fitting, a FCS<br>

dilution series and confocal bead scanning. The results are compared in

the view of quantitative<br>

FCS measurement and analysis. Artifacts like aberration, cover-slide

thickness effects<br>

and saturation are compared to theoretical calculations.<br><br>

</font><font face="Arial, Helvetica">*</font>Licenciado en Fisica

(Diplomphysiker), Freie Universitaet Berlin. Doctorando del Departamento

de Optica Biomedica del Physikalisch- Technische Bundesanstalt Berlin

sobre Quantitative Fluorescence Microscopy and Single Molecule Techniques

<font face="Arial, Helvetica">(tesis a completar durante 2006).<br><br>

</font></body>

</html>